Variable Mikrotubuli-Architektur im Malariaparasiten

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1216 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Mikrotubuli sind ein allgegenwärtiges eukaryotisches Zytoskelettelement, das typischerweise aus 13 Protofilamenten besteht, die in einem Hohlzylinder angeordnet sind. Diese Anordnung gilt als kanonische Form und wird mit wenigen Ausnahmen von den meisten Organismen übernommen. Hier verwenden wir In-situ-Elektronenkryotomographie und Subvolumenmittelung, um das sich verändernde Mikrotubuli-Zytoskelett von Plasmodium falciparum, dem Erreger der Malaria, während seines gesamten Lebenszyklus zu analysieren. Unerwarteterweise weisen verschiedene Parasitenformen unterschiedliche Mikrotubulistrukturen auf, die durch einzigartige Organisationszentren koordiniert werden. Bei Merozoiten, der am häufigsten untersuchten Form, beobachten wir kanonische Mikrotubuli. Bei wandernden Mückenformen wird die 13 Protofilamentstruktur durch unterbrochene Lumenhelices weiter verstärkt. Überraschenderweise enthalten Gametozyten eine breite Verteilung von Mikrotubulistrukturen mit 13 bis 18 Protofilamenten, Dubletts und Tripletts. Eine solche Vielfalt an Mikrotubuli-Strukturen wurde bisher bei keinem anderen Organismus beobachtet und ist wahrscheinlich ein Beweis für eine unterschiedliche Rolle in jeder Lebenszyklusform. Diese Daten bieten einen einzigartigen Einblick in ein ungewöhnliches Mikrotubuli-Zytoskelett eines relevanten menschlichen Krankheitserregers.

Mikrotubuli sind eine wichtige Komponente des Zytoskeletts in allen Zweigen von Eukaryoten. Sie bilden Bahnen für den intrazellulären Transport, strukturelle Unterstützung für die Fortbewegung und Spindeln für die Chromosomentrennung. Durch die Polymerisation von α-/β-Tubulin-Heterodimeren entstehen Protofilamente, die seitlich interagieren und sich zu einem Hohlzylinder zusammenfügen. Der Mikrotubulus mit 13 Protofilamenten gilt als kanonisch, da diese Struktur am häufigsten in umfassend untersuchten eukaryotischen Supergruppen beobachtet wurde. Während frühe Elektronenmikroskopiker mehrere Beispiele nicht-kanonischer Mikrotubuli fanden1, führten die Schwierigkeit bei der Reinigung funktionellen nativen Tubulins einiger Arten und die übermäßige Abhängigkeit von Modellorganismen dazu, dass unser Verständnis der Mikrotubuli-Biologie hauptsächlich auf der Untersuchung von Metazoen-Mikrotubuli basierte. Nicht-kanonische Beispiele wie die 11-Protofilament-Mikrotubuli spezialisierter Zellen in Nematoden2,3 und die 15-Protofilament-Mikrotubuli von Innenohr-Säulenzellen4,5 gelten als merkwürdige Ausreißer. Das Ergebnis ist, dass, obwohl Protozoen eine große und vielfältige Gruppe sind, viele unserer Hypothesen über ihre Mikrotubuli aus Metazoenstudien abgeleitet wurden.

Die eukaryotischen Protozoenparasiten von Plasmodium spp. basieren auf einem Gerüst aus geordneten subpellikulären Mikrotubuli (SPMTs) als ihren wichtigsten strukturellen Zytoskelettkomponenten. P. falciparum, der Erreger der Malaria, hat einen komplexen Lebenszyklus, der zwischen Mückenüberträger und menschlichem Wirt wechselt (Abb. 1). Die ausgedehnte Koevolution mit den beiden Wirten hat dazu geführt, dass der Erreger eine Vielzahl hochspezialisierter und morphologisch unterschiedlicher Zelltypen nutzt, die hier als Formen bezeichnet werden. Obwohl jede Form eine bestimmte Nische beherrscht und morphologisch unterschiedlich ist, ist das Vorhandensein von SPMTs ein verbindendes Merkmal. SPMTs liegen darunter und interagieren mit einer Doppelmembran, die als innerer Membrankomplex (IMC) bekannt ist und sich unter der Plasmamembran befindet. Zusammen werden diese Strukturen als Häutchen bezeichnet, das in allen Apicomplexa vorkommt, einschließlich beispielsweise Toxoplasma gondii. Das Häutchen wird im Übergang abgebaut und dann während der Reifung jeder Lebenszyklusform wieder aufgebaut, und jedes Mal wird es von einem anderen Satz assoziierter Proteine ​​begleitet6,7. Diese Neuorganisation ist eine treibende Kraft hinter den erheblichen morphologischen Veränderungen des Parasiten, und SPMTs spielen in diesem Prozess eine Schlüsselrolle8.

ein vereinfachter Plasmodium-Lebenszyklus der hier untersuchten Parasitenformen. Sporozoiten werden in den Wirt injiziert. Nach der Differenzierung in der Leber werden Merozoiten ins Blut abgegeben. Die Mehrheit tritt in einen asexuellen Replikationszyklus ein (Merozoiten) und ein kleiner Prozentsatz entwickelt sich zu Gametozyten. Gametozyten werden von einer Mücke aufgenommen und nach der Verschmelzung männlicher und weiblicher Gameten im Mückendarm verwandeln sich Zygoten in Ookineten. Ookineten durchqueren den Mitteldarm der Mücke, entwickeln sich zu Oozysten und bilden Tausende von Sporozoiten, die in die Speicheldrüsen wandern. b Schematische Darstellung unseres Arbeitsablaufs: (i) lebende Parasiten werden auf EM-Gitter vitrifiziert. (ii) Zellen werden zu Lamellen verdünnt und dann (iii) durch Elektronen-Kryo-Tomographie (Kryo-ET) abgebildet. Neigungsreihen werden gesammelt und rechnerisch in 3D-Volumina rekonstruiert. c Spalten 1–4: repräsentative Bilder von Parasiten in verschiedenen Arbeitsschritten. 1: Zusammensetzung von Fluoreszenzbildern von Zellen, die die Gesamtform des Parasiten hervorheben. Einschub: Cartoon-Darstellung jeder Stufe. 2: Rasterelektronenmikroskopische (REM) Aufnahmen, die Plasmodium-Parasiten (einige in Falschfarben in Gelb und Grün) zeigen, umgeben von Wirtszellen (grüne Sternchen). 3: Mikroaufnahmen, die Übersichten von Lamellen zeigen. 4: Schnitte durch Beispiel-Tomogramme.

Obwohl eukaryotische Tubuline hochkonserviert sind, gibt es erhebliche Unterschiede, die apicomplexan-Mikrotubuli hervorheben. Die SPMTs des Parasiten sind äußerst stabil und resistent gegen die meisten klassischen Depolymerisationsprotokolle wie Kältebehandlungen9, Zugabe von Mikrotubuli-depolymerisierenden Arzneimitteln10 und Reinigungsmitteln11,12. Ein weiteres einzigartiges Merkmal von Apicomplexan-Tubulin ist die Bildung von L-förmigen Halbtubuli, die mit akzessorischen Proteinen eine helikale Struktur bilden, die als Konoid bezeichnet wird13,14. Der Konoid ist eine spezielle Struktur, die an der Invasion beteiligt ist. Obwohl in Toxoplasma charakterisiert, werden Homologe einiger Konoidkomponenten in Plasmodium spp.15 exprimiert.

In vitro aus gereinigtem Tubulin zusammengesetzte Mikrotubuli bestehen aus 9 bis 16 Protofilamenten, wobei die Verteilung der Protofilamentzahlen je nach Art und verwendeten Bedingungen unterschiedlich ist1,16. Da diese Variationen normalerweise nicht in Zellen vorkommen, muss daher während der Keimbildung durch externe Faktoren die Festlegung einer einheitlich aus 13 Protofilamenten bestehenden Mikrotubuli-Population festgelegt werden. Es gibt vier gängige Mechanismen zur Steuerung der Anzahl der Protofilamente in einem Mikrotubulus: Templatierung über den γ-Tubulin-Ringkomplex (γTuRC)17,18, Einstellung eines spezifischen Inter-Protofilament-Winkels durch laterale Bindung von Proteinen wie Doublecortin19,20, Expression von verschiedene Tubulin-Isoformen21 oder posttranslationale Modifikationen22. Bei Metazoen erfolgt die Keimbildung von Mikrotubuli normalerweise an Zentrosomen (Mikrotubuli-Organisationszentren, MTOCs). Bei den invasiven Formen apikomplexer Parasiten koordiniert ein strukturell vielfältiger MTOC an ihrem apikalen Ende, der Apical Polar Ring (APR), die räumliche Kontrolle höherer Ordnung von SPMTs23, der spezifische Mechanismus bleibt jedoch unbekannt.

Um die Vielfalt der Mikrotubuli in Plasmodium spp. direkt zu visualisieren, bilden wir vier verschiedene Formen des Parasitenlebenszyklus unter nativen Bedingungen ab, indem wir kryogenes fokussiertes Ionenstrahlfräsen (FIB), Elektronentomographie (Kryo-ET) und Subvolumenmittelung (SVA) verwenden (Abb. 1). ). Indem wir diese Strukturen in ihrem natürlichen Kontext, in 3D, aufdecken, entdecken wir eine ungewöhnliche Zytoskelettarchitektur, in der jede Parasitenform eine eigene, spezialisierte Mikrotubuli-Struktur aufweist, von denen sich einige erheblich von den kanonischen Mikrotubuli unterscheiden.

Um die In-situ-Strukturen von Mikrotubuli in verschiedenen Plasmodium-Formen zu bestimmen, führten wir FIB-Fräsen und Kryo-ET an zwei Mückenformen (Sporozoiten und Ookineten) und zwei menschlichen Formen (Merozoiten und Gametozyten, Abb. 1) durch. Wir führten gezieltes FIB-Fräsen durch (Abb. 1b), um an Stellen mit Parasiten Lamellen mit Dicken zwischen 50 nm und 300 nm zu erzeugen. Ursprünglich wurde die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) verwendet, um auf EM-Gittern vitrifizierte Parasiten zu identifizieren. Später fanden wir heraus, dass ihre charakteristischen Formen im SEM (Abb. 1c, Spalte 2) ein Targeting ohne Korrelation ermöglichten. Für jedes Stadium haben wir zwischen 50 und 100 Tomogramme von etwa 20 Lamellen aufgenommen, um eine gute Abdeckung verschiedener subzellulärer Regionen zu erhalten. Wir haben eine manuelle Auswahl durchgeführt, um die SVA umfassend an allen Mikrotubuli durchzuführen und so vollständige Ultrastrukturmodelle zu erstellen und eine statistische Analyse zu ermöglichen. Um mögliche Verzerrungen zu vermeiden, wurden alle ca. 850 einzelnen Mikrotubuli im Datensatz unabhängig voneinander mit SVA analysiert. Dadurch konnten wir die strukturelle Variabilität, einschließlich der Anzahl der Protofilamente und der relativen Polarität24, sowohl innerhalb jeder Zelle als auch zwischen den vier Lebenszyklusformen untersuchen.

Wir begannen unsere Studie mit der Abbildung von Parasitenformen, die aus dem Mückenvektor isoliert wurden: Sporozoiten und Ookineten. Diese beweglichen Formen sind mit einem dichten SPMT-Gerüst unter dem IMC verlängert. Auf den ersten Blick enthielt das Lumen von SPMTs sowohl in Sporozoiten als auch in Ookineten eine (Pseudo-)Helixdichte mit einer Periodizität von ~8 nm, was mit früheren Vorhersagen übereinstimmt (Abb. 2, 3)11. Um eine unverfälschte EM-Dichtekarte zu erstellen, wurden 422 Sporozoiten- und 177 Ookineten-SPMTs durch SVA analysiert, ohne jegliche (Pseudo-)Symmetrie anzuwenden. Beide resultierenden Strukturen zeigten 13-Protofilament-Mikrotubuli mit zweimal unterbrochenen Lumenhelices (Abb. 2b – d, 3c). Ähnliche Strukturen, sogenannte Interrupted Luminal Helices (ILH), wurden erstmals in Flagellenenden menschlicher Spermien25 und in jüngerer Zeit in Pferde- und Schweinespermien26 sowie Tachyzoiten von Toxoplasma gondii14,27 beobachtet. Wir haben die Nomenklatur von Zabeo et al25 übernommen. Das T. gondii-ILH besteht aus den Thioredoxin-ähnlichen Proteinen 1 und 2 (TrxL1, TrxL2) und dem subpellikulären Mikrotubuli-Protein 1 (SPM1). Wir stellten die Hypothese auf, dass das ILH in Plasmodium und Toxoplasma wahrscheinlich aus homologen Proteinen besteht: Erstens Plasmodium spp. haben Homologe von TrxL1 (PfTrxL1) und SPM1 (PfSPM1), aber es fehlt TrxL2, das im Toxoplasma ILH in beiden vorhanden ist und eine der beiden Unterbrechungen vollständig ausfüllt. Konsequenterweise beobachteten wir in Plasmodium ausschließlich doppelt unterbrochene Lumenhelices. Zweitens sahen wir in Übereinstimmung mit der Zusammensetzung des ILH aus SPM1 und TrxL1 in Plasmodium eine hohe Expression von PbSPM1-GFP und PbTrxL1-GFP in Plasmodium berghei (Pb) in unseren endogen markierten Sporozoitenlinien (Abb. S2). Schließlich sind Plasmodium und Toxoplasma TrxL1 und SPM1 hoch konserviert (Abb. S1a, b), und das Modell der T. gondii SPMT-Anordnung (pdb 7MIZ) passt gut in unsere EM-Karten (Abb. 2c, d). Aufgrund der asymmetrischen Natur des ILH gibt es nur eine Möglichkeit, die ILH-Struktur von T. gondii in die EM-Dichte von Plasmodium-SPMTs einzupassen. Wir schlagen daher vor, dass P. falciparum ILH aus 10 Kopien von PfTrxL1 besteht, wahrscheinlich mit einer äquivalenten Anzahl von PfSPM1, die in zwei Halbmonde aufgeteilt ist (Abb. 2c). Dies stellte uns auch eine zuverlässige Methode zur Verfügung, um sowohl die Nahtposition als auch die Position von Alpha-Beta-Tubulin in unserer Struktur zu identifizieren (Abb. 2c, d).

a Schnitt durch ein Tomogramm, das die Gesamtarchitektur des Häutchens innerhalb einer Zelle veranschaulicht. Ein SPMT ist zu sehen, wie er sich in die Schnittebene hinein und aus ihr heraus bewegt. Einschübe: Schnitte durch die EM-Karte (dargestellt in B, C, D), die an durch SVA bestimmten Positionen wieder in das Tomogramm eingefügt werden. b Orthogonale Schnitte durch die EM-Karte. c Isoflächendarstellung der EM-Karte mit pseudoatomarem Modell (7MIZ), eingepasst in die EM-Dichte. p1-p13 = Protofilamentnummern, gestrichelte Linie = Nahtposition. d Oben: Schnitt durch die EM-Karte, der die Position eines α/β-Tubulin-Dimers relativ zu TrxL1 zeigt. Unten: Radialprojektion mit einer violett hervorgehobenen Periode des ILH. e Der apikale Pol eines P. falciparum-Sporozoiten mit einem vollständigen Satz Mikrotubuli (13 blau + 1 grün). Der APR wird durch eine Isofläche dargestellt, die SPMTs als Pin-Modelle, bei denen der Pinkopf die Mitte markiert und die Linie zur Naht hin ausgerichtet ist. f Segmentierter Sporozoiten-Apikalpol. Die Tubulindichte (13 Protofilamente) von zwei SPMTs wurde ausgeblendet, um die ILH sichtbar zu machen. Unbeschrifteter Schnitt durch das Tomogramm, dargestellt in Abb. S3a, und das gesamte Volumen im Zusatzfilm S1.

ein Tomogramm-Schnitt durch das apikale Ende einer Ookinete mit SPMTs, die entlang der apiko-basalen Achse ausgerichtet sind. Ein Cartoon einer Ookinete auf der rechten Seite zeigt die ungefähren Mittelpositionen der Lamellen in a, b und d. b Schnitt durch einen proximalen Bereich der Ookinetenspitze mit transversal geschnittenen SPMTs, die Anmerkungsfarben sind die gleichen wie in a. SPMTs nähern sich dem IMC, wenn sich der innere apikale Kragen verjüngt (von links nach rechts). Die Rotationsausrichtung der SPMTs (Mitte zur Naht) wird durch Pfeile angezeigt. c Orthogonale Schnitte durch die EM-Karte, bestimmt durch SVA von ookineten SPMTs. d Segmentierung eines apikalen proximalen Bereichs einer Ookinete mit quer geschnittenen SPMTs, Hervorhebung der beiden apikalen Kragenschichten zwischen den SPMTs und dem IMC. Der Konoid ist grün dargestellt. e Segmentierung des apikalen Pols einer Ookinete. Die Tubulindichte eines SPMT wurde ausgeblendet, um den ILH sichtbar zu machen. Der Einschub zeigt einen Schnitt durch ein durchschnittliches Volumen der konoiden periodischen Struktur. Unbeschrifteter Schnitt durch das Tomogramm, dargestellt in Abb. S3b und vollständiges Volumen im Zusatzfilm S2.

Obwohl die meisten bisher gelösten Mikrotubuli-Strukturen einen annähernd kreisförmigen Querschnitt haben, sind Plasmodium-Mikrotubuli mit ILH und in geringerem Maße T. gondii-Mikrotubuli mit ILH (Abb. S1c, d) entlang einer imaginären Achse ungefähr zwischen den Protofilamenten 2 und 9 abgeflacht. Dies impliziert, dass die ILH den Winkel zwischen den Protofilamenten bei ~26° stabilisiert, was um ~2° von den theoretischen 27,7° der kanonischen 13-Protofilament-Mikrotubuli abweicht (Abb. S1c, d). Die Abweichung vom kreisförmigen Querschnitt akkumuliert sich über 5 Untereinheiten und wird dann durch einen relativen Winkel von 37° zwischen den Protofilamenten 6 und 7 sowie 12 und 13 ausgeglichen. Vergleiche der vorhergesagten Struktur von Plasmodiums TrxL1 mit der von T. gondii zeigten, dass der größte Der Unterschied liegt an der N-terminalen Helix (Abb. S1e), die für einen großen Teil der Untereinheit-Untereinheit-Grenzfläche verantwortlich ist und möglicherweise eine Rolle bei der erhöhten Elliptizität spielt.

Am apikalen Ende der Ookinete beobachteten wir eine Struktur, die einem klassischen Konoid entsprach und aus einer einzigartigen Tubulinstruktur bestand (N = 1, Abb. 3e). Der durchschnittliche Volumenquerschnitt stimmt mit dem in T. gondii14 beschriebenen L-förmigen Tubulin-Konoid überein. Der Ookineten-Konoid hatte eine Höhe von 70 nm und einen Durchmesser von 300 nm, was einem eingefahrenen Zustand ähnelte. Bis vor Kurzem ging man davon aus, dass Plasmodium (gehört zur Klasse der Aconoidasida, d. h. ohne Konoid) keinen Konoid besitzt. Unsere Daten validieren frühere genetische, fluoreszenzmikroskopische und klassische EM-Daten, die auf das Vorhandensein einer kegelförmigen Struktur an der Spitze des Ookineten hinweisen15,28.

Basierend auf unseren Mückenformdaten und den jüngsten Strukturen von T. gondii schien es plausibel, dass die ILH ein allgegenwärtiges Merkmal apikomplexer Mikrotubuli ist. Um zu verifizieren, dass dies ein universelles Merkmal in allen Lebenszyklusformen ist, haben wir als nächstes P. falciparum-Formen des menschlichen Wirts analysiert. Um außerdem zu beurteilen, ob das Vorhandensein eines ILH spezifisch für SPMTs oder eine allgemeine Mikrotubuli-Komponente ist, haben wir zu zwei Zeitpunkten der Schizontenentwicklung Bilder aufgenommen. Für SPMTs haben wir vollständig segmentierte Schizonten (Merozoiten) abgebildet, während wir für Spindelmikrotubuli darauf abzielten, Schizonten zu teilen. Das asexuelle Blutstadium, der Merozoit, der aus einem reifen Schizonten hervorgeht, ist eine kleine Zelle mit nur zwei bis drei SPMTs (Abb. 4). Merozoiten sind kurzlebig; Um die Abbildung nicht lebensfähiger Zellen zu vermeiden, haben wir Schizonten vor dem Austritt mit einem gut charakterisierten Proteaseinhibitor (E64)29 ​​gestoppt, was zu Merozoiten in Erythrozytenmembransäcken führte.

a Schnitt durch ein Tomogramm eines apikalen Pols. Einschub: Schnitt durch das durchschnittliche Mikrotubuli-Subvolumen mit 13 Protofilamenten. b Segmentierung eines Kerns in einem sich teilenden Schizonten mit einem Teilspindelkörper. Alle vier in diesem Abschnitt des Kerns beobachteten Kernporenkomplexe befinden sich in der Nähe der Spindel. Einschub: Schnitt durch eine Isofläche der SPMT-EM-Karte. c Segmentierung eines einzelnen Merozoiten innerhalb eines vollständig segmentierten Schizonten. Hinweis: Zur Vereinfachung ist die IMC als kontinuierliche Doppelmembran segmentiert, obwohl mehrere Diskontinuitäten beobachtet wurden. Unbeschrifteter Schnitt durch das Tomogramm, dargestellt in Abb. S3c und vollständiges Volumen im Zusatzfilm S3.

Unerwarteterweise und im Gegensatz zu Mückenformen gab es in Merozoiten-SPMTs kein ILH (Abb. 4a, c). Die Analyse durch SVA ergab, dass Merozoiten-SPMTs kanonisch sind, dh aus 13 Protofilamenten bestehen. In ähnlicher Weise waren Spindelmikrotubuli aus sich teilenden Schizonten kanonisch und hatten kein ILH (Abb. 4b). Im Gegensatz zu SPMTs, die nicht abgedeckt waren, enthielten Spindelmikrotubuli jedoch eine Verschlussdichte an ihren Minusenden, die γTuRC ähnelte (Abb. S4c)30. Dies deutete darauf hin, dass sich die Mikrotubuli-Zytoskelettstrukturen von Plasmodium je nach Lebenszyklusstadium verändern und dass unterschiedliche Populationen von Mikrotubuli durch unterschiedliche Mechanismen entstehen können.

Nachdem wir herausgefunden hatten, dass sich die Mikrotubuli-Strukturen zwischen den Mückenformen und der asexuellen Merozoiten-Blutform unterscheiden, machten wir uns als nächstes daran, die SPMTs in den sexuellen Gametozyten zu untersuchen. Der Gametozyten von P. falciparum entwickelt sich in fünf morphologischen Stadien von einer runden zu einer länglichen und schließlich falciformen Form. SPMTs beginnen im Stadium II zu polymerisieren und im Stadium IV umgeben sie das Zytoplasma vollständig. Wir haben Gametozyten in verschiedenen Stadien des Reifungsprozesses angereichert und ihre Mikrotubuli untersucht.

Die Häutchenbedeckung nahm mit den nachfolgenden Entwicklungsstadien zu und damit auch die Anzahl der SPMTs in jeder Zelle. In allen Gametozytenstadien hatten SPMT-Querschnitte auffällig große und variable Durchmesser im Bereich von 27 bis 37 nm und bestanden aus einer Mischung von Singuletts, Dubletts, Tripletts (häufig mit ungewöhnlichen Geometrien) und sogar einem Quadruplett (Abb. 5, S5). ). Dies war unerwartet, da in allen bisher untersuchten Organismen die zytoplasmatischen Mikrotubuli einzelne Röhren (Singulett-Mikrotubuli) sind und frühere Studien über Mikrotubuli mit kleinerem Durchmesser berichteten31. Dubletten (kanonisch bestehend aus 13 + 10 Protofilamenten) und Drillinge finden sich in Zilien und Flagellen26,32, wobei Drillinge Kennzeichen von Zentriolen sind. In Übereinstimmung mit Merozoiten-SPMTs fanden wir in diesen riesigen Mikrotubuli keine Hinweise auf eine ILH. SVA wurde unabhängig an jedem der ~170 Singulett- und ~30 A-Tubuli von Dublett-SPMTs durchgeführt und zeigte erstaunlicherweise, dass sie aus 13, 14, 15, 16, 17 oder 18 Protofilamenten bestanden (Abb. 5c, Tabelle S1). Obwohl einige kanonische Mikrotubuli vorhanden waren, machten diese nur 9 % der Population aus, während Mikrotubuli mit 17 Protofilamenten am häufigsten vorkamen (40 %) (Abb. 5c). Dubletten waren ebenfalls riesig und ihre A-Tubuli hatten eine ähnliche Verteilung, wobei 17 Protofilamente am häufigsten vorkamen (Abb. S5b, c). Überraschenderweise gab es angesichts der Allgegenwärtigkeit eines A-Tubuli mit 13 Protofilamenten in anderen Organismen keine A-Tubuli mit 13 Protofilamenten. Die Vielfalt der Protofilamentzahlen unterscheidet die Gametozyten-SPMT-Population deutlich von allen anderen Formen. Ob dies auf eine Gametozyten-spezifische SPMT-Keimbildung oder einen anderen Mechanismus zurückzuführen ist, könnte durch einen Vergleich mit Mikrotubuli in anderen Zellkompartimenten untersucht werden.

Eine mikroskopische Aufnahme, die eine Reihe von Singulett- und Dublett-SPMT-Querschnitten zeigt und den Größenbereich hervorhebt. Die Anzahl der Protofilamente ist angegeben (für Dubletts des A-Röhrchens). Mikroaufnahmen bei zwei unterschiedlichen Neigungswinkeln wurden zusammengefügt, um SPMT-Queransichten zu zeigen. b Segmentierung eines Gametozytenkerns im Stadium III mit einem Spindelpolkörper an einem Kernporenkomplex. Die Farben der Mikrotubuli entsprechen den Protofilamentzahlen, wie in c, dc dargestellt. Balkendiagramm der Verteilung verschiedener Protofilamentzahlen in SPMTs (blau) N = 155 und Kernspindeln (lila) N = 31. Die Verteilungen sind deutlich unterschiedlich (p = 5 × 10−). 8, Chi-Quadrat). d Isoflächen von Mikrotubuli aus der Subvolumen-Mittelung mit Protofilamentzahlen von 13 bis 18. e Schematische Darstellung der Unterschiede im Mikrotubuli-Durchmesser. f Segmentierung eines Gametozyten im Stadium III mit quer geschnittenen SPMTs. Die Farben der Mikrotubuli entsprechen den Protofilamentzahlen, wie in c, d gezeigt. „+/−“ gibt die Polarität jedes Mikrotubulus an. Unbeschrifteter Schnitt durch das Tomogramm, dargestellt in Abb. S3d und vollständiges Volumen im Zusatzfilm S4.

Abgesehen von SPMTs gibt es in Gametozyten zwei weitere Mikrotubulipopulationen: Kernspindel (oder Hemispindel33) und Zytoplasma. Zytoplasmatische Mikrotubuli sind kurzlebig und erscheinen nur in Gametozyten im Frühstadium auf der dem sich entwickelnden Häutchen gegenüberliegenden Seite der Zelle34. Folglich sind zytoplasmatische Mikrotubuli relativ selten. Wir beobachteten eine Mischung aus Protofilamentzahlen (13 bis 16, Abb. S5e), und obwohl es Hinweise auf eine Clusterbildung nach Protofilamentgröße gab, konnte dies aufgrund der geringen Zahlen nicht bestätigt werden. Kernmikrotubuli wurden häufig bei Gametozyten-Parasiten im Stadium III/IV beobachtet und in einem Tomogramm war ein vollständiger Spindelpolkörper vorhanden (Abb. 5b). Spindelmikrotubuli umfassten 13 bis 17 Protofilamente, wobei 15 am häufigsten vorkamen (Abb. 5b, c). Dies war unerwartet, da alle Minusenden unabhängig von der Protofilamentzahl eindeutig mit einer Struktur bedeckt waren, die γTuRC sein könnte (obwohl sie im Vergleich zur kanonischen Form abgeflacht ist). Bemerkenswert ist, dass γTuRC bisher ausschließlich in kanonischen Mikrotubuli beschrieben wurde (Abb. S4d). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die weite Verteilung der Protofilamentzahlen eher auf eine unterschiedliche Isoform-Expression oder eine posttranslationale Modifikation als auf einen Keimbildungsmechanismus zurückzuführen sein könnte.

Nachdem wir erhebliche strukturelle Unterschiede zwischen den Mikrotubulipopulationen zwischen den vier einzelnen Formen beobachtet hatten, konzentrierten wir unsere Analyse auf die apikalen Anordnungen, in denen die Keimbildung von SPMTs stattfindet. Bei den invasiven Parasitenformen (Merozoiten, Sporozoiten und Ookineten) fungieren Proteinringe (APR) am apikalen Pol als einzigartige MTOCs, die zusätzlich zur Terminierung des IMC SPMTs koordinieren. In Übereinstimmung damit hatten alle SPMTs sowohl in Mückenformen als auch in Merozoiten die gleiche Polarität, wobei ihre Minus-Enden am apikalen Pol und ihre Plus-Enden in Richtung des Basalzellpols reichten. Bei allen invasiven Formen waren ihre Minusenden stumpf und es fehlte eine γTuRC-Kappe, obwohl sich möglicherweise zusätzliche Mikrotubuli-assoziierte Proteine ​​(MAPs) im Lumen der Minusenden von Ookineten befinden (Abb. S4a). Obwohl alle drei Formen 13-Protofilament-SPMTs mit derselben Polarität enthielten, gab es große Unterschiede in der Architektur ihrer apikalen Pole (Abb. 2–4).

Die Spitze des Merozoiten war die einfachste, da nur zwei bis drei Mikrotubuli vom APR ausgingen (Abb. 4c). Anstatt gleichmäßig über den APR verteilt zu sein, entstanden alle SPMTs auf derselben Seite des Rings. Sporozoiten enthielten eine größere Anzahl an SPMTs. In zwei Tomogrammen konnten wir vollständige Sporozoiten-APRs mit einem vollständigen Satz von 13 eng beieinander liegenden und einem einzigen gegenüberliegenden SPMT sehen (Abb. 2e, f, S6). Die Minusenden des SPMT standen scheinbar in direktem Kontakt (Abb. S6a) und bündig mit der apikalen Kante des APR. Allerdings hatte jedes SPMT einen anderen Anstellwinkel relativ zur Rotationssymmetrieachse des Rings, die um etwa 45°35 von der apikobasalen Achse des Parasiten geneigt ist (Abb. S6c, d). Der SPMT-APR-Kontakt muss daher ein hohes Maß an Flexibilität ermöglichen. Im Gegensatz dazu war die radiale Ausrichtung des SPMT eingeschränkt, wobei die Protofilamente 6 bis 9 vorzugsweise mit dem APR in Kontakt standen (Abb. S6c).

Die aufwändigste Spitze wurde bei Ookineten beobachtet, mit zwei konzentrischen Schichten aus amorphem Protein anstelle eines einzelnen Rings (Abb. 3). Aufgrund des großen Unterschieds in der Morphologie bevorzugen wir die Bezeichnung „Apical Collar“ (AC)15, APR ist jedoch aufgrund der funktionellen Ähnlichkeit gleichermaßen angemessen. Beide Ringe trennten sich auf ihrer Basalseite in Tentakel (Abb. 3b, d, e), wobei der innere AC bis zu ~ 1 µm in direktem Kontakt mit einzelnen SPMTs stand und diesen folgte. Um die große Anzahl von SPMTs in dieser Form (~ 50–60) im schmalen apikalen Ende unterzubringen, entstanden die Minusenden der Mikrotubuli an versetzten Positionen vom apikalen AC-Rand (Abb. 3e).

Gametozytenzellen weisen im Gegensatz zu den deutlich polaren Zellen der drei oben beschriebenen invasiven Formen keine klare Zellpolarität auf (Abb. 2–4). Wir beobachteten keine Hinweise auf eine APR-ähnliche Struktur oder eine andere Struktur, die als MTOC an den Gametozytenpolen fungieren könnte, und SPMTs entstanden an scheinbar unkoordinierten Positionen entlang der Zelllänge. Anders als bei den invasiven Formen, bei denen alle SPMTs die gleiche Polarität mit Minusenden am apikalen Ende hatten, hatten Gametozyten-SPMTs eine scheinbar zufällige Polarität (Abb. 5f, Tabelle S1). Darüber hinaus war kein Muster in der Verteilung der SPMTs entlang des IMC in Bezug auf die Anzahl der Protofilamente oder Sekundärtubuli erkennbar (Abb. 5f, Tabelle S1). In Anbetracht der Tatsache, dass SPMTs in den drei früheren Formen keine γTuRC-Kappe hatten, hatten wir zunächst die Hypothese aufgestellt, dass SPMT-Keimbildungsfaktoren physikalisch mit dem APR oder AC verbunden sein könnten. Eine gezielte Analyse der Gametozyten-SPMT-Minusenden zeigte jedoch, dass auch diese nicht abgedeckt waren (Abb. S4). Zusammengenommen deutet dies auf einen γTuRC-unabhängigen Keimbildungsmechanismus hin, der nicht eindeutig mit dem APR assoziiert ist.

Obwohl Plasmodium-Parasiten in jedem Schritt ihres Lebenszyklus ihre Mikrotubuli-Struktur, MTOCs und Mikrotubuli-Organisation höherer Ordnung verändern, ist die Interaktion von SPMTs mit dem IMC ein einheitliches Merkmal. Um herauszufinden, ob die SPMT-IMC-Wechselwirkung bei allen Parasitenformen auf die gleiche Weise vermittelt wird, haben wir den kürzesten Abstand (dIMC) von der Oberfläche jedes SPMT zur inneren IMC-Membran gemessen (Abb. 6). Ein ähnlicher dIMC in allen Parasitenformen würde darauf hindeuten, dass dieselben Proteine ​​an der Anbindung von SPMTs an den IMC beteiligt sind. Mit Ausnahme der apikalen Anordnungen gab es keinen signifikanten Unterschied im dIMC zwischen den vier Parasitenformen (mit einem gemeinsamen Median von 18 nm und einer Standardabweichung von 10 nm, Abb. 6d). Dieser Abstand vergrößerte sich am Ookineten-Apex auf ~50 und ~100 nm, um den Wechselstrom aufzunehmen, aber der Abstand von der SPMT-Oberfläche zur nächstgelegenen Oberfläche, dem inneren Wechselstrom, war mit dIMC vergleichbar (~13 nm, Abb. 6a). . Somit zeigen wir, dass, obwohl jede Stufe eine einzigartige SPMT-Struktur aufweist, der Abstand zwischen den SPMTs und dem IMC zwischen den Stufen gleich bleibt. Wir gehen daher davon aus, dass in allen analysierten Parasitenformen dieselben Proteine ​​die SPMTs mit dem IMC verbinden.

Abbildungen a–c links: Streudiagramme des individuellen SPMT-Abstands (dIMC) und der radialen Ausrichtung (φIMC) in Bezug auf den IMC. Jeder Punkt repräsentiert den Median entlang eines einzelnen SPMT. Ookineten- und Sporozoiten-SPMTs haben eine definierte Polarität, während die Ausrichtung der Gametozyten zufällig ist (siehe Abb. S7 für eine 2D-Histogrammdarstellung dieser Daten). Cartoons in Parasitenform zeigen subzelluläre Orte an, an denen Datenpunkte erfasst wurden: am Zellkörper oder an der Spitze. Rechts: durchschnittliche SPMT-Volumina, die an den angegebenen subzellulären Stellen entnommen wurden. Obwohl sich die Teilvolumenmittelung auf SPMTs konzentrierte, sind IMC- und APR-Komponenten in den EM-Karten nach der Extraktion großer Teilvolumina (200-nm-Kanten) zu sehen. Dies ist eine Folge des konsistenten SPMT-IMC-Abstands und der konsistenten Ausrichtung. Cartoons mit unterdurchschnittlichem Volumen sind Modelle der Pellicle-Architektur an jedem Standort. Beachten Sie, dass es nicht möglich war, einen einzelnen apikalen dIMC zu messen, da sich der IMC um den torusförmigen Sporozoiten APR wickelt (apikale φIMC-Winkel sind in Abb. S6b dargestellt). Das Gametozyten-Panel (c) zeigt Schnitte durch einzelne SPMTs und nicht einen Durchschnitt, um deren inkonsistente Ausrichtungen und unterschiedliche Anzahl von Protofilamenten anzuzeigen. *Siehe ergänzende Materialien für Einzelheiten und Annahmen bei der Zuordnung der Gametozytenorientierung. d Violindiagramm zum Vergleich von dIMC zwischen Formularen, Breiten werden entsprechend der Datenmenge skaliert.

Mit der Hypothese, dass ein gemeinsamer Linker die SPMTs in allen Formen an den IMC bindet, und mit dem Wissen, dass SPMTs in Mückenform eine bevorzugte radiale Ausrichtung haben (Abb. 2e, 3b, S6b, c, S7), machten wir uns an die Suche für die Linker-Bindungsstelle. Ein klarer Kandidat war die Naht, da es sich um ein ausgeprägtes asymmetrisches Strukturmerkmal handelte. Wir haben den Winkel φIMC zwischen der Naht, dem Mikrotubuli-Zentrum und dem nächstgelegenen Punkt auf der IMC-Oberfläche gemessen (Einzelheiten zur Nahtorientierung finden Sie in den Zusatzinformationen).

Die Analyse des mittleren φIMC für alle möglichen SPMTs ergab, dass nur SPMTs im Mückenstadium eine festgelegte radiale Polarität aufweisen. Überraschenderweise zeigt die Naht vom IMC weg und das Protofilament 8 ist stattdessen darauf ausgerichtet (Abb. 6a, b, S6, S7). Im Gegensatz zu den Mückenformen wurde in Gametozyten keine Clusterbildung von φIMC beobachtet, was darauf hindeutet, dass das Linkerprotein in dieser Lebenszyklusform keine spezifische Bindungsposition aufweist (Abb. 6c).

Obwohl diese Ergebnisse nicht auf allen SPMTs eine universelle Bindungsstelle für den Linker fanden, legten sie nahe, dass der ILH an der Festlegung der radialen Ausrichtung in Bezug auf den IMC beteiligt war. Wir haben die SPMT-EM-Dichtekarte im Mückenstadium auf mögliche Hinweise untersucht. Selbst bei niedrigen Konturniveaus gab es keine Verknüpfungsdichte zwischen SPMT und IMC, was darauf hindeutet, dass jedes Linkerprotein flexibel ist oder bei geringer Besetzung vorhanden ist. Dennoch gab es einige Hinweise auf eine radialasymmetrische Dekoration mit einer unbekannten Proteindichte zwischen den Protofilamenten 10, 11 und 12, wobei zusätzliche Dichte radial nach außen von den Protofilamenten 11 und 12 ausging (Abb. S8). Wenn diese Dichten einem Teil des SPMT-IMC-Linkers entsprechen, müssten wahrscheinlich zusätzliche SPMT-IMC-Verbindungen vorhanden sein (möglicherweise an Protofilament 6 oder 7), um die beobachtete radiale Ausrichtung von Protofilament 8 in Richtung IMC zu ermitteln. Obwohl die genauen Details eines Linkers noch geklärt werden müssen, legen wir Hinweise auf asymmetrische Dekoration und radiale Polarität vor, die wahrscheinlich ILH-abhängig sind, in den Mikrotubuli der Mückenform.

Der Parasit P. falciparum hat einen komplexen Lebenszyklus entwickelt und bewegt sich durch mehrere verschiedene Gewebe innerhalb seines menschlichen Wirts und Mückenvektors. Für jede neue Umweltnische erfährt der Parasit extreme morphologische Veränderungen. Während sich der Parasit für jede Nische in neue, spezielle Formen verwandelt, werden seine Mikrotubuli zerlegt und anschließend wieder zu mehreren einzigartigen, zweckmäßigen Strukturen zusammengesetzt, die durch ungewöhnliche MTOCs koordiniert werden (Abb. 7). Während das apikale Ende der Ookinete am ausgefeiltesten ist und ein Tubulin-basiertes Konoid enthält, zeichnen sich Gametozyten unter den anderen Formen durch das Fehlen eines APR und die vielfältige Population von Mikrotubuli-Strukturen aus (Abb. 5, 7).

a Cartoon-Darstellungen der vier analysierten Plasmodium-Formen. b Tabelle mit einer Zusammenfassung der wichtigsten architektonischen Unterschiede in den vier Formen. Durchgezogene Umrisse weisen auf Eigenschaften hin, die wahrscheinlich miteinander korrelieren: Das Vorhandensein eines apikalen Polarrings legt die SPMT-Polarität fest und ILH ist direkt mit der Einstellung der Nahtorientierung in Bezug auf den IMC verknüpft.

Gametozyten weisen eine große Bandbreite und Vielfalt an Mikrotubulistrukturen auf, darunter Singuletts mit 13 bis 18 Protofilamenten sowie riesige Dubletts, Tripletts und Vierlinge. Eine solch große strukturelle Vielfalt ist bisher beispiellos, was Fragen über den zugrunde liegenden Mechanismus und die physiologische Rolle aufwirft. Nach unserem derzeitigen Verständnis wird die Anzahl der Protofilamente streng kontrolliert, bei Gametozyten ist dies jedoch offenbar nicht der Fall. Mikrotubuli neigen dazu, sich in vitro selbst zu organisieren, wenn auch in Konzentrationen, die erheblich über den physiologischen liegen. Diese spontane Selbstorganisation führt zu Mikrotubulipopulationen mit einer breiten Verteilung der Protofilamentzahlen (9–16 für Rinderhirntubulin)1,16. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass eine keimbildungsfreie Selbstorganisation für die riesigen nichtkanonischen SPMTs in Gametozyten verantwortlich ist, da ihre Polymerisation auf die Oberfläche wachsender IMC-Platten beschränkt ist und nicht spontan im Zytoplasma. Darüber hinaus beobachteten wir gelegentlich Gruppen zytoplasmatischer Mikrotubulipopulationen, die möglicherweise nach Durchmesser geclustert waren (Abb. S5e), was darauf hindeutet, dass ein gewisses Maß an Kontrolle verfügbar ist.

Eine erhöhte Anzahl an Protofilamenten könnte auf veränderte posttranslationale Modifikationen oder die Expression einer neuen MAP- oder Tubulin-Isoform zurückzuführen sein. Plasmodium spp. exprimieren eine β- und zwei α-Tubulin-Isoformen. Obwohl α1- und α2-Tubulin eine Sequenzidentität von etwa 95 % aufweisen, gibt es in Schlüsselregionen mehrere Aminosäuresubstitutionen. Beispielsweise fehlen α2-Tubulin drei Aminosäuren an seinem C-Terminus (häufig ein Ziel für posttranslationale Modifikationen), und die am wenigsten konservierte Region in der Sequenz entspricht einer Schleife, die Interaktionen innerhalb des Protofilaments vermitteln kann. Diese kleinen Veränderungen könnten letztendlich zu Veränderungen im Mikrotubuli-Gitter führen und die Bildung von B-Tubuli fördern, was zu Dubletts und Tripletts führt36. Darüber hinaus haben frühere Studien zu Tubulin-Isoformen beim Menschen gezeigt, dass der relative Anteil einer Isoform innerhalb eines Mikrotubulus das Mikrotubulus-Gitter modulieren kann37, was eine mögliche Erklärung für den beobachteten Bereich der Protofilamentzahlen darstellt. Obwohl α2-Tubulin wahrscheinlich in allen Lebenszyklusformen exprimiert wird, ist seine relative Expression in sexuellen Stadien am höchsten38,39. Diese Isoform war in aus asexuellen Stadien gereinigten Mikrotubuli nicht vorhanden40, ist in asexuellen Formen nicht essentiell41 und kann α1-Tubulin in P. berghei-Sporozoiten nur teilweise ersetzen42.

P. falciparum ist die einzige Plasmodium-Art, die verlängerte Gametozyten produziert43, und ihre SPMTs sind nachweislich polyglutamatisiert, was möglicherweise eine Rolle für ihre Stabilität spielt28,44. Die reifenden Gametozyten weisen eine verminderte Verformbarkeit auf45, was eine Rolle bei der Hemmung der vorzeitigen Freisetzung von Gametozyten aus Sequestrierungsstellen im Knochenmark spielt und so eine Clearance aus der Milz verhindert46. Gametozyten sind im Stadium IV am steifsten, wenn alle Mikrotubuli zusammengesetzt sind. Allerdings werden die Zellen im Stadium V, wenn der Großteil der SPMTs zerlegt wurde, wieder verformbar, was auf einen Zusammenhang zwischen Zellsteifigkeit und SPMTs hindeutet.

Wir gehen davon aus, dass riesige Mikrotubuli deutlich steifer sind (weniger wahrscheinlich, dass sie sich verbiegen) als die kanonische Form. Es wird erwartet, dass der Übergang von 13 Protofilamenten zu 17 oder 18 Protofilamenten die Steifigkeit eines einzelnen Mikrotubulus erheblich erhöht, da ein Wechsel von 13 zu 15 Protofilamenten voraussichtlich zu einer Erhöhung der Steifigkeit um 35 % führen würde47. Diese erhöhte Steifigkeit zeigt sich beispielsweise in mechanosensorischen Zellen, deren 15-Protofilament-Mikrotubuli an der Mechanotransduktion beteiligt sind. Da die Gametozytenperipherie eine begrenzte Oberfläche hat, kann eine begrenzte Anzahl von Mikrotubuli auf die Innenfläche des IMC passen. Daher kann die Maximierung der Anzahl der Mikrotubuli sowie der Zusammenbau größerer, starrerer Mikrotubuli es P. falciparum-Gametozyten ermöglichen, in ihre ausgedehnte, starre Form zu wachsen und sich in ihren menschlichen Wirten ungestört zu entwickeln, bis sie reif sind.

Die beiden Mückenformen hingegen verfügen über ihre eigenen einzigartigen SPMTs, die aus 13 Protofilamenten bestehen und charakteristischerweise mit einem ILH verstärkt sind. Unsere Beobachtungen tragen zu einer wachsenden Liste von Organismen bei, die ein ILH in ihrem Mikrotubuli-Zytoskelett nutzen, zu der mittlerweile auch die SPMTs von Apicomplexans14,27 und die Zilien und Flagellen einiger Säugetiere25,26 gehören. Aufgrund unserer Beobachtungen ist es wahrscheinlich, dass ILH, das aus TrxL1- und SPM1-ähnlichen Proteinen besteht, im gesamten Apicomplexa konserviert ist, jedoch nur in einigen Lebenszyklusformen. Das TrxL1-Expressionsprofil in veröffentlichten Daten stimmt mit unserer Beobachtung überein, da seine Transkription in Ookineten und Sporozoiten stark hochreguliert ist und die relative Expression in Blutstadien sehr gering ist38,48. In unseren TrxL1-GFP- und SPM1-GFP-Linien sahen wir hohe Expressionsniveaus bei Sporozoiten (Abb. S2). Interessanterweise gibt es bei Säugetieren ein Homolog von TrxL1, das sich in Lungenflimmerhärchen und Spermienglagellen lokalisiert (Thioredoxin-ähnliches Txl-249), und ein Homolog von SPM1 in Axonemen (Stabilisator der axonemalen Mikrotubuli SAXO250), was darauf hindeutet, dass ILH häufig vorkommt eukaryotisches Merkmal.

Es wurde angenommen, dass der ILH den Umsatz am Mikrotubuli-Plus-Ende begrenzt und SPMTs sowohl in Längsrichtung (über SPM1) als auch in Querrichtung (TrxL1) stärkt25,26. Eine SPM1-Nullmutante in T. gondii hatte eine verringerte Fitness12. Dies wurde in einer zweiten Studie nicht beobachtet, obwohl Mikrotubuli anfälliger für chemische Behandlungen waren, wenn SPM1 oder TrxL127 fehlten. Auffällig ist, dass ILH in Bewegungsstrukturen wie Zilien, Flagellenenden und apikomplexen Gleitformen auftritt. Daher postulieren wir, dass das ILH Stabilität bietet, ohne die Flexibilität zu beeinträchtigen, und dass SPM1 bei Brüchen die Enden zusammenhält und so eine SPMT-Reparatur oder Selbstheilung ermöglicht. Wo ausschließlich Steifigkeit erforderlich ist, haben Plasmodium-Gametozyten eine dichte Schicht aus SPMTs mit einer großen Anzahl von Protofilamenten, Dubletts und Tripletts entwickelt.

Die Funktion von SPMTs als Zytoskelettelemente beruht auf einer physischen Verbindung zum IMC. Bei der Untersuchung der Verbindung zwischen den SPMTs und dem IMC stellten wir fest, dass die Rotationsorientierung der ILH-haltigen SPMTs in Bezug auf den IMC festgelegt war. Überraschenderweise war die Naht nicht zum IMC hin ausgerichtet. Dies steht im Einklang mit früheren Daten zur Nahtorientierung von abgeflachtem, durch Detergens solubilisiertem T. gondii14 und verdeutlicht diese, bleibt jedoch überraschend, da die Naht das einzige wirklich asymmetrische Mikrotubuli-Merkmal ist, auf das durch extern bindende MAPs zugegriffen werden kann. Stattdessen könnte der ILH die Rotationsausrichtung direkt festlegen. Gametozyten, denen ein ILH fehlt, haben eine scheinbar zufällige radiale Polarität. Unser Beweis dafür war die große Varianz des Dublett-φIMC, aber darüber hinaus ist es auch schwierig, die Supertwist nicht-kanonischer Mikrotubuli mit einem Linker in Einklang zu bringen, der ein bestimmtes Protofilament bevorzugt (da unterschiedliche Protofilamente auf das IMC als Mikrotubuli gerichtet sind). Wendungen). Wir schlagen vor, dass die radiale Polarität von 13-Protofilament-SPMTs in Merozoiten ebenfalls zufällig ist, da angeblich ein asymmetrisches Merkmal wie das ILH fehlt.

Es gibt zwei denkbare Mechanismen, wie die ILH SPMTs ausrichten könnte. Entweder ein direkter Kontakt zwischen einer ILH-Komponente und einem externen MAP oder indem SPMTs in elliptische Querschnitte gezwungen werden (Abb. S1), wo die inkonsistenten Winkel zwischen den Protofilamenten als Bindungsstellen erkannt werden könnten. Wir beobachteten schwache Dichten, die von den Protofilamenten 11 und 12 und in den Graten zwischen den Protofilamenten 9 bis 12 ausgehen (Abb. S8). Diese Dichten stimmen nicht mit bekannten MAPs wie Kinesin oder Doublecortin überein, aber die Auflösung unserer C1-Symmetrie-EM-Dichtekarten ist nicht hoch genug, um schlüssig zu sein. Es ist nicht klar, ob sie einem mutmaßlichen SPMT-IMC-Linker entsprechen, da sie nicht auf den nächstgelegenen Punkt auf dem IMC ausgerichtet sind. Ein Rahmen zum Verständnis der Entwicklung der asymmetrischen Rotationsorientierung von SPMTs könnte eine kürzlich vorgeschlagene Hypothese sein, dass SPMTs aus einem alten Flagellum stammen51,52. Die Ausrichtung von ILH-haltigen SPMTs stimmt in etwa mit der Ausrichtung des A-Tubulus in Axonemen in Bezug auf die Membran überein. Ob diese radiale Polarität für die Orchestrierung des Richtungsgleitens wichtig ist, muss getestet werden.

Die Unterschiede in den Mikrotubuli-Strukturen zwischen Plasmodium-Formen werfen die offensichtliche Frage auf; Wie entstehen diese verschiedenen Mikrotubuli? Es wurde vermutet, dass SPMTs mit ILH durch SPM127 nukleiert werden könnten. TrxL1 könnte dann durch die Krümmung seines oligomeren Zustands die Protofilamentzahl auf 13 einstellen. Dies erscheint isoliert betrachtet plausibel, jedoch nicht angesichts unserer neuen Daten. Es erklärt nicht, wie die riesigen Mikrotubuli von Gametozyten oder Merozoiten-13-Protofilament-SPMTs, denen das ILH fehlt, einen Kern bilden. Darüber hinaus weicht die Krümmung der TrxL1-gebundenen Protofilamente von der eines kanonischen 13-Protofilament-Mikrotubulus ab (Abb. S1) und es gibt eine Lücke im ILH zwischen den Protofilamenten 13 und 1, in die möglicherweise zusätzliche Protofilamente eingefügt werden könnten. γTuRC ist ein unwahrscheinlicher Keimbildungsmechanismus, da die SPMT-Minusenden in allen beobachteten Mikrotubuli aller Formen nicht abgedeckt waren (Abb. S4). Obwohl es möglich ist, dass die γTuRC-Kappen zerlegt wurden (γ-Tubulin wird beispielsweise in Schizonten ausgedrückt53), wäre dies aufgrund der Stabilität der Plasmodium-Mikrotubuli überraschend. Es ist schwierig, über die Natur der Keimbildung riesiger Mikrotubuli in Gametozyten zu spekulieren. Einerseits könnte man über eine γTuRC-unabhängige Keimbildung von SPMTs spekulieren, die Protofilamentzahlen von 13 bis 18 ermöglicht. Andererseits gibt es aber auch das Vorhandensein einer γTuRC-ähnlichen Struktur auf Spindelmikrotubuli, die dennoch nicht in der Lage ist, homogene Mikrotubuli zu erzeugen Bevölkerung. Aktuelle Daten deuten darauf hin, dass zumindest anfängliche SPMTs in Gametozyten an einer zentriolaren Plaque in der Kernmembran kernisiert sind44. Wie mit diesem Modell Mikrotubuli mit unterschiedlichem Durchmesser und die von uns beobachtete zufällige Polarität von SPMTs erreicht werden können, muss noch untersucht werden. Zusammengenommen könnten diese Daten auf einen neuartigen SPMT-Keimbildungsmechanismus und damit auf ein potenzielles Ziel für Antimalariamittel hinweisen.

In dieser Arbeit enthüllen wir die Metamorphose von Mikrotubulistrukturen im gesamten Lebenszyklus von P. falciparum. Auf höchster Ebene zwingt uns die bemerkenswerte strukturelle Vielfalt dazu, unsere Vorurteile über die kanonischen Mikrotubuli zu überdenken, die aus der übermäßigen Abhängigkeit von einer kleinen Anzahl von Modellorganismen resultieren. Die hohe Auflösung und optimale Strukturerhaltung der hier vorgestellten In-situ-Daten bieten einen Rahmen für die Integration von Erkenntnissen aus anderen, eher reduktionistischen Methoden, um ein vollständiges Bild des Zytoskeletts eines Organismus zu erhalten. Wir gehen davon aus, dass die tatsächliche Vielfalt eukaryotischer Mikrotubulistrukturen und ihrer Nischenfunktionen größer sein wird als derzeit angenommen, da immer mehr Zelltypen mit den derzeit verfügbaren Techniken untersucht werden.

P. falciparum-Blutformen wurden in menschlichen roten Blutkörperchen (O + oder B +, Universitätsklinikum Eppendorf, Hamburg, Deutschland) bei 5 % Hämatokrit, 1 % O2, 5 % CO2 und 94 % N2 bei 37 °C in RPMI kultiviert Komplettmedium mit 0,5 % Albumax II54.

Schizonten wurden mit 60 % vorgewärmtem Percoll55 geerntet, einmal mit vorgewärmtem RPMI gewaschen, in 5 % nicht infizierten roten Blutkörperchen in vorgewärmtem RPMI resuspendiert und 3 Stunden lang kultiviert, bis die Parasiten austraten und wieder eindrangen. Nicht aufgebrochene Schizonten wurden mit 5 % Sorbitol lysiert. Die verbleibende Kultur enthielt junge Ringe mit einem 3-Stunden-Synchronizitätsfenster.

Eng synchronisierte 3D7-Schizonten, die endogen GFP-markiertes GAPM2 (Glideosomen-assoziiertes Protein mit mehreren Membranspannweiten 256,57) exprimieren, wurden aus einer 10–20-ml-Kultur (5–10 % Parasitämie) unter Verwendung von 60 % Percoll 55 isoliert und zweimal im Vorfeld gewaschen. erwärmtes RPMI und behandelt mit 1 µM der PKG-Inhibitorverbindung 2 (bereitgestellt von Dr. Mike Blackman, The Francis Crick Institute, UK)58,59 und 6 Stunden lang inkubiert. Segmentierte Schizonten wurden einmal gewaschen und dann in vorgewärmtem RPMI ohne Albumax oder Phenolrot, aber mit der Zugabe von 1 µM E64 (Sigma) resuspendiert, um das Platzen der parasitophoren Vakuole zu ermöglichen, aber ein Platzen der roten Blutkörperchenmembran zu verhindern. Dies half uns, Schizonten im sehr späten Stadium im SEM zu identifizieren. Die Zellen wurden warm gehalten und innerhalb einer Stunde vitrifiziert.

Gametozytenstadien wurden durch gezielte Überexpression des sexuellen Bindungsfaktors GDV1 (Gametozytenentwicklung 1) unter Verwendung einer 3D7-induzierbaren Gametozytenproduzentenlinie (iGP) wie zuvor beschrieben60 erzeugt, wobei eine GFP-markierte Version des Nahtinnenmembrankomplexproteins PF3D7_1345600 (Plasmid aus57) überexprimiert wurde. Die GDV1-GFP-DD-Expression wurde durch Zugabe von 2 oder 4 µM Shield-1 zu einer Parasitenkultur mit 2–3 % Ringen erreicht. Schild-1 wurde weitere 48 Stunden bis zur erneuten Invasion aufrechterhalten. Die Probe wurde auf 10 % Parasitämie eingestellt und 10 Tage lang in RPMI, ergänzt mit 10 % menschlichem Serum (Blutgruppe AB+), kultiviert, um die Reifung der Gametozyten zu ermöglichen. Um nicht gebundene asexuelle Formen zu dezimieren, wurden Gametozyten mindestens 4 Tage lang mit 50 mM N-Acetyl-d-glucosamin (GlcNac) behandelt. Das Kulturmedium wurde mindestens einmal täglich auf einer 37 °C heißen Heizplatte gewechselt. Die Gametozytenstadien II, III, IV und V wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten während der Gametozytenreifung aus einer 20-ml-Kultur unter Verwendung von 60 % vorgewärmtem Percoll isoliert. Isolierte Gametozyten wurden zweimal gewaschen und dann in vorgewärmtem RPMI ohne Albumax, Serum oder Phenolrot resuspendiert und bis unmittelbar vor dem Einfrieren warm gehalten (zwischen 15 und 45 Minuten).

P. falciparum-Sporozoiten (Stamm: NF54-ΔPf47-5'csp-GFP-Luc: exprimiert ein GFP-Luciferase-Fusionsprotein) unter der Kontrolle des csp-Promotors, genomische Integration, kein Selektionsmarker61 wurden bei TropIQ (Nijmegen, Niederlande) hergestellt. .Gametozyten wurden an 2 Tage alte weibliche Anopheles stephensi-Mücken verfüttert. Die Mückeninfektion wurde 7 Tage nach der Infektion durch Mitteldarmsektion bestätigt. Sieben Tage nach der Infektion erhielten die infizierten Mücken eine zusätzliche, nicht infektiöse Blutmahlzeit, um die Sporozoitenproduktion anzukurbeln. Zwei Wochen nach der Infektion wurden Sporozoiten mittels Speicheldrüsensektion isoliert und bei Raumtemperatur nach Hamburg verschifft.

Ookinetes wurden unter Verwendung der P. berghei-Linie PbRFP hergestellt, einer P. berghei ANKA-Linie, die RFP konstitutiv exprimiert. Zwei weiblichen Swiss-Mäusen wurden 200 µl Phenylhydrazin (6 mg/ml in PBS) intraperitoneal injiziert, um die Retikulozytose zu stimulieren. Zwei Tage später wurden die Mäuse intraperitoneal mit 20*106 iRBC PbRFP infiziert. Drei Tage nach der Infektion wurde den Mäusen Blut entnommen und 500 µl Blut wurden auf 10 ml Ookinete-Medium übertragen (RPMI, ergänzt mit 20 % (v/v) FCS, 50 µg/ml Hypoxanthin und 100 µM Xanthurensäure, eingestellt auf pH 7,8 – 8,0). bei 19 °C. Nach 22 Stunden Kultivierung wurden die Ookinetenkulturen mit 5 ml 55 % Nycodenz/PBS unterschichtet und 25 Minuten lang bei 210 xg ohne Bremse zentrifugiert. Die gereinigte Ookineten enthaltende Interphase wurde gesammelt, in PBS gewaschen und sofort für EM tiefgefroren.

Die Zellen wurden in einem 37 °C warmen Wärmeblock neben dem Tauchgefrierschrank warm gehalten. 3 µl angereicherte Parasiten wurden in einer feuchtigkeitskontrollierten Anlage auf ein frisch plasmagereinigtes UltrAufoil R1.2/1.3 300 Mesh EM-Gitter (Quantifoil) aufgetragen. Überschüssige Flüssigkeit wurde manuell abgetupft und die Gitter wurden mit einem manuellen Kolben in ein Reservoir mit Ethan/Propan getaucht. Die Gitter wurden bis zur Bildgebung unter flüssigem Stickstoff gelagert.

Die Gitter wurden in für die FIB-Vorbereitung62 modifizierte Autogrids eingeklemmt und entweder in ein Aquilos-Mikroskop oder ein verbessertes Aquilos2-Kryo-FIB/REM-Zweistrahlmikroskop (Thermofisher Scientific) geladen. Übersichtsfliesensätze wurden mit der MAPS-Software (Thermofisher Scientific) aufgezeichnet, bevor sie mit einer dünnen Platinschicht durch Sputtern beschichtet wurden. Für die Lamellenpräparation wurden gute Stellen mit Parasiten identifiziert, bevor der Koinzidenzpunkt zwischen dem Elektronenstrahl und dem Ionenstrahl für jeden Punkt durch Tischneigung bestimmt wurde. Vor dem Mahlen wurde mithilfe eines GIS (Gasinjektionssystem) eine metallorganische Platinschicht auf die Gitter aufgebracht. Lamellen wurden manuell in einer schrittweisen Reihe abnehmender Ströme bis unter 300 nm gemahlen. Das Fräsen wurde in den kleinstmöglichen Winkeln durchgeführt, um die Lamellenlänge in dünnen Zellen zu erhöhen. Schließlich wurde das Polieren aller Lamellen am Ende der Sitzung so schnell wie möglich, jedoch immer innerhalb von 1,5 Stunden, durchgeführt, um eine Eiskontamination durch Wasserablagerungen auf der Oberfläche der Lamellen zu begrenzen. Vor der Entnahme der Proben wurden die Gitter mit einer abschließenden dünnen Platinschicht durch Sputtern beschichtet. Die Gitter wurden vor der Bildgebung im TEM maximal 2 Wochen in flüssigem Stickstoff gelagert.

FIB-gefräste Gitter wurden um 90° gedreht und in ein Titan-Krios-Mikroskop (Thermofisher) geladen, das mit einem K2- oder K3-Direktelektronendetektor und einem (Bio-) Quantenenergiefilter (Gatan) ausgestattet war. Tomografische Daten wurden mit SerialEM63 gesammelt, wobei der Energieauswahlspalt auf 20 eV eingestellt war. Datensätze wurden unter Verwendung des dosissymmetrischen Erfassungsschemas in einem Neigungsbereich von ± 65° mit Neigungsschritten von 3° erfasst. Für alle Datensätze wurden 5–10 Bilder gesammelt und im laufenden Betrieb mithilfe von SerialEM ausgerichtet, und die Gesamtfluenz wurde auf weniger als 120e−/Å2 gehalten. Zur Aufnahme der Neigungsserie wurden Defoci zwischen 3 und 8 μm Unterfokus verwendet.

Frames wurden im laufenden Betrieb in SerialEM ausgerichtet; CTF-Schätzung, Phasenumkehr und Dosisgewichtung wurden in IMOD64 durchgeführt. Neigungsserien wurden in IMOD entweder mithilfe von Patch-Tracking oder mithilfe von Nanopartikeln (wahrscheinlich Gold oder Platin) auf Lamellenoberflächen als Referenzmarkierungen ausgerichtet. Tomogramme wurden 4x gruppiert und in IMOD oder mit Bsoft65 gefiltert.

Die SVA wurde in PEET66 mit Tomogrammen bei zunehmend niedrigerem Binning durchgeführt. Anfängliche 3D-Koordinaten (Modellpunkte oder Partikelkoordinaten) für SVA wurden durch Interpolation zwischen manuell verfolgten Mikrotubulizentren in IMOD unter Verwendung von auf TEMPy67 basierenden Skripten und unter Verwendung der Python-Bibliotheken Numpy, Scipy und Matplotlib68,69,70 generiert. Die Vektoren zwischen Punktpaaren wurden verwendet, um die anfängliche Ausrichtung der Partikel-Y-Achse (Pseudosymmetrieachse der Mikrotubuli) festzulegen. Jeder Mikrotubulus wurde separat verarbeitet und an einer eindeutigen Referenz (Rohdurchschnitt) ausgerichtet, die durch Mittelung der jeweiligen Partikel mit anfänglichen Orientierungen generiert wurde (Abb. S9). Um seine Polarität und die Anzahl der Protofilamente zu bestimmen, wurden die anfänglichen Rotationen um die Y-Achse (hier als φ-Rotation bezeichnet) randomisiert (Abb. S9, Schritt 2). Anschließend wurden Partikel gleicher Form mit gleicher Anzahl an Protofilamenten zur weiteren Verarbeitung kombiniert. Der Fortschritt der SVA wurde durch die Untersuchung von Stiftmodellen in der UCSF-Chimäre (Abb. 2e) überwacht, wobei die Position und Ausrichtung jedes Partikels durch ein Markerpaar dargestellt wurde. Dadurch konnten wir beispielsweise Ausreißer aus der linearen Geometrie identifizieren und entfernen. Partikel wurden beschnitten, wenn sie sich mit anderen überlappten, einen niedrigen Kreuzkorrelationskoeffizienten aufwiesen oder zu weit von ihren ursprünglichen Positionen entfernt waren. SPMT-Karten wurden mit Bsoft65 mithilfe willkürlicher B-Faktoren geschärft.

Nachdem die relative Polarität bestimmt wurde, besteht der notwendige Schritt zum Kombinieren darin, die relative φ-Rotation (Rotation um die Symmetrieachse) zwischen einzelnen Mikrotubuli zu ermitteln. Dies könnte dadurch erreicht werden, dass jedes einzelne Partikel auf eine gemeinsame Referenz ausgerichtet wird, würde jedoch aufgrund des geringen Signal-Rausch-Verhältnisses zu einer großen Anzahl von Fehlern führen. Wir haben eine Methode analog zu der von Zabeo et al.25 entwickelt, bei der die durchschnittlichen Volumina der Mikrotubuli aneinander ausgerichtet werden, um ihre relative φ-Rotation zu ermitteln (Abb. S9, Schritt 4). Diese φ-Rotationen wurden dann auf ihre jeweiligen Partikel angewendet und auf eine gemeinsame Referenz ausgerichtet. Anschließend wurde die SVA mit 4- und 2-fach gruppierten Volumina durchgeführt. Lediglich die Sporozoitendaten wurden mit nicht klassifizierten Volumina abgeglichen; Der letzte Schritt bestand darin, die mit den gesamten Neigungssätzen rekonstruierten Volumina durch Volumina zu ersetzen, die mit Neigungen zwischen ±24° rekonstruiert wurden. Mit dem eingeschränkten Neigungsbereich wurde keine Rotationssuche durchgeführt. Die resultierende C1-EM-Karte war aufgrund einer ungleichmäßigen Verteilung der Rotationsorientierungen der Mikrotubuli um die Pseudosymmetrieachse anisotrop. Um dieses Problem zu lösen, wurden die Partikel nach ihrer Orientierung in Klassen eingeteilt und die Partikel mit den niedrigsten Kreuzkorrelationskoeffizienten in den am häufigsten vorkommenden Klassen wurden entfernt. Dadurch verringerte sich die Anzahl der Partikel von 24028 auf 13263 in den Sporozoiten-Datensätzen und von 8377 auf 1851 in den Ookineten-Datensätzen.

Ungefähr 200 Mikrotubuli aus 25 Tomogrammen wurden einzeln verarbeitet, mit zufälligen anfänglichen φ-Rotationen. Die Daten wurden dann manuell nach Protofilamentnummer klassifiziert, auf die gleiche Polarität gedreht und mit 4- und 2-fach gruppierten Volumina abgeglichen. Helical-Parameter wurden direkt anhand von Klassendurchschnitten gemessen, mit Ausnahme der 13- und 15-Protofilament-Klassen, bei denen Tubulin-Untereinheiten nicht aufgelöst wurden und veröffentlichte Parameter verwendet wurden (Tabelle S2)71. Es wurde eine spiralförmige Symmetrie angewendet, gefolgt von einer SVA-Ausrichtung.

SPMT-Dubletts wurden analog zu Ookineten- und Sporozoitendaten verarbeitet, wobei Durchschnittsvolumina zur Bestimmung der relativen φ-Rotationen verwendet wurden. SPMTs mit unterschiedlicher Anzahl von Protofilamenten in A- und B-Tubuli wurden miteinander kombiniert, was zu einem Ensemble-Durchschnittsvolumen führte.

Die Partikel wurden in zwei Hälften geteilt (geradzahlige und ungeradzahlige Partikel). Zu jedem Partikel wurden zufällige Koordinatenversätze von bis zu ±2 nm und zufällige Winkelversätze von bis zu ±3° hinzugefügt und die resultierenden Parameter wurden verwendet, um einen Rohdurchschnitt für jeden halben Datensatz neu zu generieren. Die Ausrichtung der beiden Hälften erfolgte dann unabhängig voneinander mit zweimal eingeteilten und dann nicht eingeteilten Volumina, wobei dem gleichen Verfahren wie beim gesamten Datensatz gefolgt wurde. Die Fourier-Shell-Korrelation wurde mit Bsoft gemessen.

EM-Karten und Atommodelle wurden mit UCSF (University of California San Francisco) Chimera72 oder UCSF ChimeraX73 visualisiert. Rechenabschnitte wurden in IMOD erstellt.

ClustalOmega74,75 wurde zum Alignment der TrxL1-Proteinsequenzen und JalView zur Visualisierung76 verwendet. Die Farben basieren auf der ClustalX-Farbgebung.

Die Segmentierung wurde manuell in IMOD mithilfe von Zeichenwerkzeugen und anschließender linearer Interpolation durchgeführt. Die resultierenden Modelle wurden verwendet, um segmentierte Volumina zu extrahieren. SPMTs, Ookineten-Konoide und Sporozoiten-APR wurden rückwärts aufgetragen: Durchschnittsvolumina wurden unter Verwendung der durch SVA ermittelten Koordinaten in 3D-Volumina eingefügt. SPMT- und APR-Partikel wurden per Spline-Anpassung angepasst, um Ausrichtungsfehler zur Visualisierung auszugleichen. Segmentierte und rückwärts aufgetragene Volumina wurden mit UCSF ChimeraX73 visualisiert.

Tomogramme wurden mit Bsoft bandpassgefiltert. Die Segmentierung der gefilterten Tomogramme wurde durch einen Tensor-Voting-Algorithmus unter Verwendung von TomoSegMemTV77,78 gesteuert. Die Parameter wurden jeweils für jeden Datensatz optimiert. Cluster, die die IMC-Segmentierungen enthielten, wurden manuell durch visuelle Analyse extrahiert. Anschließend wurden die Cluster in eine 3D-Punktwolke umgewandelt und mithilfe der Open3D-Bibliothek78 weiterverarbeitet. Mithilfe einer statistischen Ausreißeranalyse wurde überschüssiges Rauschen aus den Segmentierungen entfernt. Anschließend wurde der DBSCAN-Algorithmus zur Trennung einzelner Membranabschnitte verwendet und die Außenseite des IMC manuell für nachfolgende Abstandsmessungen ausgewählt. Der Winkel φIMC wurde zwischen zwei Vektoren für jedes SPMT-Partikel gemessen: einem Vektor der X-Achse des SPMT-Partikels und einem Vektor vom Partikelzentrum zur nächstgelegenen segmentierten IMC-Koordinate (ungefähr äquivalent zum IMC-Normalenvektor, der das SPMT-Partikel schneidet). Partikel außerhalb segmentierter Membranflecken wurden ausgeschlossen. Die Messungen einzelner Mikrotubuli wurden für die grafische Darstellung und statistische Analyse auf einen Medianwert reduziert.

Die Anforderung einer klaren Membrandichte für die automatisierte Segmentierung reduzierte die Anzahl der für die Analyse verfügbaren Mikrotubuli erheblich. Aufgrund der Seltenheit von SPMTs in Merozoiten, Dubletts in Gametozyten und Minustermini in Ookineten wurde eine kleine Anzahl von Tomogrammen manuell in IMOD segmentiert.

Zunächst wurde das SPMT-Modell von T. gondii (PDB 7MIZ) als starrer Körper in Chimera72 an die Sporozoiten-SPMT-Karte von P. falciparum angepasst. Die Anpassung wurde dann in ChimeraX73 visualisiert. Die resultierende Anpassung war eindeutig mit TgTrxL2 (das nicht in Plasmodium exprimiert wird, aber Teil des Toxoplasma-ILH ist) außerhalb und den verbleibenden Proteinketten innerhalb der Karte. Aufgrund der unterschiedlichen Elliptizität zwischen den Karten von P. falciparum und T. gondii wurden Protofilamente und TrxL1/SPM1-Halbbögen als separate Einheiten angepasst. Die Strukturvorhersage von PfTrxL1 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q8I2W0)79 wurde mithilfe von Matchmaker80 in ChimeraX mit TgTrxL1 (PDB 7MIZ) abgeglichen.

Die Winkel zwischen den Protofilamenten wurden durch Messung des Winkels zwischen Cα-Atomen desselben Restpaars in benachbarten Protofilamenten bestimmt. Es wurden Medianwerte von etwa 200 Messungen verwendet.

Die endogene Markierung erfolgte im Wesentlichen wie zuvor beschrieben unter Verwendung der Single-Crossover-Integration81. Da sowohl SPM1 als auch TrxL1 eine Gesamtgenlänge von weniger als 1 Kilobase aufweisen, wurde der gesamte offene Leserahmen aus genomischer PbANKA-Wildtyp-DNA amplifiziert. Das resultierende DNA-Fragment wurde unter Verwendung der EcoRI- und BamHI-Restriktionsstellen in den pL18-Vektor82 kloniert. Der Reverse-Primer kodierte für sechs Alanine, die als Linker verwendet wurden. Der pL18-Vektor enthält das hDHFR-Gen für die positive Selektion mit dem Wirkstoff Pyrimethamin. Vor der Transfektion wurde der Vektor mit SwaI (SPM1) bzw. BsmI (TrxL1) linearisiert, gefolgt von einer Ethanolpräzipitation. Alle zur Generierung von DNA-Fragmenten sowie zur Genotypisierung von PCRs verwendeten Oligonukleotide sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Die linearisierten pL18-SPM1-GFP/pL18-TrxL1-GFP-Vektoren wurden jeweils unter Verwendung von Standardprotokollen in einen unmodifizierten P. berghei ANKA-Stamm transfiziert83. Parasiten, die das gewünschte DNA-Konstrukt integriert hatten, wurden durch orale Verabreichung von Pyrimethamin (0,07 mg/ml) über das Trinkwasser der Maus einen Tag nach der Transfektion selektiert. Sobald die Mäuse zwischen 1–3 % infizierte rote Blutkörperchen aufwiesen, wurde Blut durch Herzpunktion anästhesierter Mäuse entnommen (100 mg/kg Ketamin und 3 mg/kg Xylazin, Sigma-Aldrich). Zur dauerhaften Lagerung von Parasitenlinien wurden Aliquots von 100 µl Vollblut, gemischt mit 200 µl Gefrierlösung (10 % Glycerin in Alsever-Lösung, Sigma-Aldrich), in flüssigem Stickstoff gelagert.

Um die korrekte Integration zu überprüfen, wurde genomische DNA aus Vollblut isoliert und durch Genotypisierungs-PCR auf korrekte Konstruktintegration getestet. Hierzu wurden Erythrozyten zunächst in 1,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,03 % Saponin lysiert. Nach Zentrifugation und zwei Waschschritten wurde die genomische DNA mit dem Blood and Tissue Kit (Qiagen Ltd) gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert. Parasiten aus diesen Transfektionen führten zu gemischten (Eltern-)Populationen, die für Mückeninfektionen verwendet wurden.

Plasmide und Oligonukleotide wurden mit SnapGene Software Version 3.2.1 (Insightful Science, verfügbar unter snapgene.com) entworfen. Die Bilder wurden mit Fiji (Version: 2.0.0 rc 64/1,51 s)84 analysiert.

Gefrorene (nicht-klonale) Parasitenbestände wurden aufgetaut und einer Maus (6–8 Wochen alte weibliche Swiss-Mäuse) direkt intraperitoneal (100–150 µl) injiziert, wobei die Infektion durch Blutausstriche überwacht wurde. Sobald die infizierte Maus 2–3 % infizierte rote Blutkörperchen erreichte, wurde die Maus anästhesiert (100 mg/kg Ketamin und 3 mg/kg Xylazin, Sigma-Aldrich), ihr wurde Blut entnommen und 20 Millionen Parasiten wurden durch intraperitoneale Injektion in zwei naive Empfängermäuse übertragen. Drei Tage nach der Frischblutübertragung wurden die Mäuse anästhesiert (120 mg/kg Ketamin und 16 mg/ml Xylazin) und in einen Käfig mit etwa 200 weiblichen Anopheles stephensi-Mücken gesetzt, die durch Entfernung von Zucker- und Salzkissen 3 bis 5 Stunden lang ausgehungert wurden . Den Mücken wurde erlaubt, sich 15 bis 30 Minuten lang von Mäusen zu ernähren. Nach der Infektion wurden die Mücken bei 21 °C und 70 % Luftfeuchtigkeit gehalten.

Speicheldrüsen-Sporozoiten wurden am 19. Tag nach der Mückenblutmahlzeit isoliert. Zu diesem Zweck wurden Speicheldrüsen in RPMI auf Eis präpariert und mit einem Stößel zerstoßen. Anschließend wurde das Röhrchen mit RPMI auf 1 ml aufgefüllt und die Lösung vorsichtig mit 3 ml 17 %iger Accudenz (Accurate Chemical & Scientific Cooperation) unterlegt. Durch 20-minütige Zentrifugation bei 1600 xg und Raumtemperatur wurden die Sporozoiten von den Zelltrümmern getrennt. Die Sporozoiten enthaltende Interphase wurde gesammelt (Gesamtvolumen 1,4 ml) und die Sporozoiten wurden 3 Minuten lang bei 100 xg zentrifugiert (Thermo Fisher Scientific, Biofuge primo). Die Resuspension pelletierter Sporozoiten in RPMI mit 3 % Rinderserumalbumin (ROTH) führte zu aktivierten Sporozoiten. Die resultierende Mischung wurde in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte mit optischem Boden (Thermo Fisher Scientific) überführt und die Platte 3 Minuten lang bei 200 xg (Multifuge S1-R, Heraeus) zentrifugiert. Sporozoiten wurden unter Verwendung eines Epifluoreszenzmikroskops (CellObserver, Zeiss) und eines 25-fachen Objektivs (NA 0,8, Wasser) mit einer Belichtung von 80 ms abgebildet. Die Bilder wurden bis 1 Stunde nach der Sporozoitenaktivierung aufgenommen.

Fluoreszenzbilder von lebenden Parasiten wurden mit einem Leica D6B-Fluoreszenzmikroskop aufgenommen, das mit einer Leica DFC9000 GT-Kamera und einem Leica Plan Apochromat 60× oder 100×/1,4-Ölobjektiv ausgestattet war. Kontrast und Intensitäten wurden linear angepasst, um mit Fidschi klare Parasitenformen darzustellen, und zugeschnittene Bilder wurden mit Adobe Illustrator CC 2021 zu einer Zellkomposition für Abb. 1 zusammengesetzt.

Es wurden fünf Präparate von P. falciparum-Gametozyten erzeugt, von denen sechs Gitter abgebildet wurden, fünf Präparate von P. falciparum-Schizonten wurden erzeugt, von denen sechs Gitter abgebildet wurden, zwei Präparate von P. falciparum-Sporozoiten wurden erzeugt, von denen vier Gitter abgebildet wurden, und zwei Präparate von P. berghei ookinetes wurden generiert, von denen drei Gitter abgebildet wurden.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Teilvolumendurchschnitte wurden in der EMDB unter den Zugangscodes Sporozoite MT (EMD-15532), Gametozyten-MTs: 13pf (EMD-15534), 14pf (EMD-15535), 15pf (EMD-15536), 16pf ( EMD-15537), 17pf (EMD-15538), 18pf (EMD-15539). Die in dieser Studie generierten Distanzmessdaten werden in der Quelldatendatei bereitgestellt. Alle Stämme und Plasmide sind auf Anfrage erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir möchten den CSSB Cryo-EM- und ALFM-Einrichtungen für ihre Unterstützung danken. Wir danken Till Voss für die 3D7-iGP-Parasiten, TropIQ für die Bereitstellung der P. falciparum-Sporozoiten und Andrew Waters und Katie Hughes für die Bereitstellung der PbRFP-Linie. Vielen Dank an Lindsay Baker für ihr kritisches Feedback zu den Ergebnissen und an John Heumann und Carolyn Moores für hilfreiche Diskussionen und Ratschläge. Vielen Dank an die Stackoverflow-Community, die ein scheinbar bodenloser und den Verstand wiederherstellender Wissensspeicher ist. Diese Arbeit wurde finanziert durch: HFSP-Langzeit-Postdoktorandenstipendium LT000024/2020-L (JLF), Infrastrukturen zur Kontrolle vektorübertragener Krankheiten (Infravec2), finanziert durch das EU-Programm Horizon 2020 (Fördervereinbarung Nr. 731060) (JLF), Interdisziplinäres Postdoc-Programm des EMBL im Rahmen von Marie Curie COFUND-Maßnahmen MSCA-COFUND-FP (Grant Agreement-Nummer: 847543) (MS), Deutsches Zentrum für Infektionsforschung, DZIF (FH), DFG-FR 2140/10-1 (AMB), DFG-Forschung Netzwerke SFB 1129, SPP 2332 und Grant FR 2140/10-1 (FF), CSSB KIF-002 (TWG und KG), DFG-Forschungsnetzwerke SPP 2225 (TWG), Wellcome Trust Grants 107806/Z/15/Z und 209250/ Z/17/ Z (KG), BMBF-Zuschuss 05K18BHA (KG), DFG INST 152/ 772-1, 774-1, 775-1, 777-1 FUGG (CSSB-KryoEM-Einrichtung).

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Josie L. Ferreira

Derzeitige Adresse: Institut für Struktur- und Molekularbiologie, Birkbeck, University of London, London, Großbritannien

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Josie L. Ferreira, Vojtěch Pražák.

Zentrum für strukturelle Systembiologie, Hamburg, Deutschland

Josie L. Ferreira, Vojtěch Pražák, Daven Vasishtan, Marc Siggel, Emma Pietsch, Jan Kosinski, Tim W. Gilberger und Kay Grünewald

Leibniz-Institut für Virologie (LIV), Hamburg, Deutschland

Josie L. Ferreira, Vojtěch Pražák, Daven Vasishtan und Kay Grünewald

Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin, Hamburg, Deutschland

Josie L. Ferreira, Emma Pietsch & Tim W. Gilberger

Abteilung für Strukturbiologie, Wellcome Centre for Human Genetics, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Vojtěch Pražák, Daven Vasishtan & Kay Grünewald

Europäisches Labor für Molekularbiologie, Hamburg, Deutschland

Marc Siggel und Jan Kosinski

Integrative Parasitologie, Zentrum für Infektionskrankheiten, Universitätsmedizin Heidelberg, Heidelberg, Deutschland

Franziska Hentzschel, Annika M. Binder & Friedrich Frischknecht

Deutsches Zentrum für Infektionsforschung, DZIF-Partnerstandort Heidelberg, Heidelberg, Deutschland

Franziska Hentzschel & Friedrich Frischknecht

Universität Hamburg, Hamburg, Deutschland

Emma Pietsch, Tim W. Gilberger & Kay Grünewald

Abteilung für Struktur- und Computerbiologie, EMBL, Heidelberg, Deutschland

Jan Kosinski

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JLF- und EP-kultivierte Parasiten im Blutstadium, AMB- und FH-präparierte Parasiten im Mückenstadium. AMB erzeugte transgene P. berghei-Linien und führte Fluoreszenzlokalisierungsexperimente durch. JLF führte Fluoreszenzmikroskopie, EM-Gittervorbereitung, FIB-Fräsen und Elektronenmikroskopie-Datenerfassung durch. JLF und VP führten eine Tomographiedatenverarbeitung, Teilvolumenmittelung und Polaritätsanalyse durch. VP und DV führten zusätzliche Analysen der Tomographiedaten durch, einschließlich Elliptizitätsanalyse und Anpassung. VP und MS führten Distanz- und Winkelanalysen in Tomographiedaten durch. JLF, VP und MS führten eine Tomogramm-Segmentierung durch. Von JLF, VP, AMB und EP erstellte Zahlen. JK, FF, TWG und KG betreuten das Projekt. JLF und VP haben den ursprünglichen Manuskripttext geschrieben und er wurde von JLF, VP, DV, MS, FH, EP, JK, FF, TWG, KG überprüft und bearbeitet.

Korrespondenz mit Kay Grünewald.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Für In-vivo-Experimente einschließlich Parasitenvermehrung und Mückeninfektionen wurden 8–10 Wochen alte weibliche Schweizer Mäuse aus Janvier-Laboren verwendet. Alle Tierversuche wurden gemäß den europäischen Vorschriften zur FELASA-Kategorie B und den GVSOLAS-Standardrichtlinien durchgeführt. Tierversuche wurden durch die deutschen Behörden (Regierungspräsidium Karlsruhe, Deutschland) genehmigt, § 8 Abs. 1 Tierschutzgesetz (TierSchG) unter der Lizenz G-111/20 und wurden nach nationalen und europäischen Vorschriften durchgeführt.

Nature Communications dankt Andreas Hoenger, Leann Tilley und Li-Av Segev Zarko für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Ferreira, JL, Pražák, V., Vasishtan, D. et al. Variable Mikrotubuli-Architektur im Malariaparasiten. Common Nat 14, 1216 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36627-5

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Eingegangen: 07. November 2022

Angenommen: 09. Februar 2023

Veröffentlicht: 3. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36627-5

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